钙敏感受体的功能特点及对成体干细胞特性的影响

钙敏感受体 (calcium-sensing receptor, CaSR) 是G-蛋白偶联受体C家族中的一员，1993和1995年，Brown和Garrett等利用克隆和基因技术先后从牛和人的甲状旁腺细胞中得到CaSR，并发现人与牛的CaSR基因序列相似性高达93%[1, 2]。研究人员相继发现CaSR不仅表达于调节体内钙离子稳态的组织，如甲状旁腺、甲状腺、肾脏、骨组织、胃肠道等，还表达于味觉组织、心血管系统、神经系统及乳腺等[3-5]，CaSR在小鼠和人的单核/巨噬细胞系、红系细胞、血小板、淋巴细胞、脐带血造血干细胞 (hematopoietic stem cells, HSCs) 和骨髓、脂肪、外周血、羊水及羊膜等来源的间充质干细胞 (mesenchymal stem cells, MSCs) 也都有表达，并参与了多种组织、细胞的功能调节，在组织器官的发育、功能发挥及相关疾病的发生、发展中也起着重要的作用[6-8]。

人的CaSR基因位于第3号染色体长臂，由1 078个氨基酸组成，可分为3个独立的结构域，细胞外结构域可形成二聚体，与多价阳离子 (Ca2+、Gd3+和Mg2+等)、精胺、聚胺、多价抗生素及芳香族L型氨基酸等结合，进而活化CaSR，启动下游信号通路，调节细胞功能特性；七次跨膜结构域主要起着细胞外结构域与G蛋白之间的信号传导作用；细胞内结构域则由包含了2个蛋白激酶A (protein Kinase A, PKA) 和5个蛋白激酶C (protein Kinase C, PKC) 的磷酸化作用位点，可与相应的G蛋白偶联发生磷酸化，激活下游信号通路，传导CaSR活化信号，影响组织细胞的功能与特征[9]。

CaSR可与细胞外Ca2+或CaSR激动剂、变构调节剂等结合而活化，直接激活G蛋白偶联的下游信号通路，其介导的经典信号转导途径主要包括[10]：①活化的CaSR引起磷脂酶C (phospholipase C, PLC) 和磷脂酰肌醇4, 5-二磷酸盐 (phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate, PIP2) 水解，进而释放1, 4, 5-三磷酸肌醇 (inositol-1, 4, 5-triphosphate, IP3) 和二酰甘油 (diacvlglycerol, DAG)，IP3与内质网表面的特异性受体结合，大量释放细胞内Ca2+；②细胞内Ca2+和DAG浓度升高，激活PKC，进而活化Ras蛋白，触发级联相关的丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase, MAPK) 信号通路，也能激活c-Jun氨基端激酶 (c-Jun N-terminal kinase, JNK)、p38促丝裂原活化蛋白激酶 (p38 mitogen-activated protein kinases, p38 MAPKs) 和细胞外信号调节激酶1/2(extracellular regulated kinase1/2, ERK1/2) 等；③信号终止于核转录因子κB (nuclear transcription factor, NF-κB)、激活物蛋白-1(activator protein-1, AP-1) 等转录因子复合物上，激活细胞膜Ca2+通道开放，引起Ca2+内流。此外，CaSR在维持细胞膜电位和体内Ca2+、Mg2+、K+等金属离子稳态，调节甲状旁腺激素分泌、离子通道激活和调控功能基因表达等方面发挥着重要作用。

机体组织器官中CaSR的活性和表达水平高低与多种疾病的发生发展密切相关，如甲状旁腺功能亢进、肺心病和心肌缺血、慢性肾病、骨性关节炎、大肠癌和乳腺癌等。

在继发性甲状旁腺亢进症中，甲状旁腺激素 (parathyroid hormone, PTH) 合成与分泌过高或甲状旁腺的病理性增生，是导致低钙高磷的关键机制[11]；维生素D受体和CaSR的激活均能使PTH合成和分泌明显下调，抑制甲状旁腺过度增生；骨化三醇也能刺激甲状旁腺CaSR高表达，间接抑制PTH合成和分泌；为此而开发的CaSR激动剂西那卡塞 (cinacalcet) 已在临床成功用于慢性肾功能衰竭等继发性甲状旁腺功能亢进的治疗[12]。肾组织的CaSR激活[13]，也可解除PTH对近曲小管吸收无机磷酸盐的抑制，并降低髓袢升支粗段钾离子通道的活性，抑制钾离子重吸收，调节集合管水通道蛋白2活性，间接调节肾小管上皮细胞对水的重吸收。

随后的研究发现，心肌CaSR的激活可通过调控G蛋白-PLC-IP3受体-Ca2+信号传导途径，调节细胞内Ca2+浓度，参与心肌的兴奋收缩偶联，并通过MAPK信号转导调控心肌细胞的衰老和凋亡，例如在特发性肺动脉高压症动物和患者的肺动脉平滑肌细胞和心肌细胞中CaSR明显高于正常对照[14]；糖尿病性心脏病患者的心肌细胞钙超载也与CaSR激活及其下游MAPK信号级联的Bax、p-JNK和p-ERK上调，Bcl-2下调及诱导心肌细胞凋亡相关，提示CaSR亦可能为一种潜在的心脏疾病治疗靶点[15]。

广泛分布于胃肠道中的CaSR除能上调G细胞胃泌素分泌，活化壁细胞的H+-K+-ATP酶，促进胃酸分泌外，还可调节肠蠕动、肠液分泌、肠细胞增殖、分化和凋亡等过程[16]。细胞外高钙通过调节VitD代谢，维持局部组织1, 25(OH)2-D3高浓度，从而由1, 25(OH)2-D3上调CaSR表达。此外，活化的CaSR能够促进成骨细胞增殖、分化和矿化，介导骨细胞的凋亡和再生；结直肠肿瘤患者肠组织中CaSR表达明显下调[17]，而乳腺癌细胞高表达CaSR可能与肿瘤骨转移有关[18]。因此，随着CaSR与各种疾病密切关系的阐明，将有助于提高疾病的早期诊断与预测进展。

随着异基因HSCs移植已越来越多的应用于临床，成为治疗多种良恶性血液病、重症自身免疫性疾病、遗传性疾病和恶性肿瘤等重大疾病的有效手段。然而，影响异基因HSCs移植成功的因素复杂多样，如HSCs的数量、归巢、骨髓微环境与长期造血免疫功能重建及移植后嵌合体形成、移植物抗宿主病的发生等。

2006年，Adams等[19]在Nature杂志上首次报道，移植HSCs后，CaSR缺陷CaSR-/-小鼠体内HSCs广泛分布于外周血和脾脏，骨髓中极少，而CaSR+/+小鼠骨髓HSCs数却远远高于CaSR-/-小鼠，因此提出激活或抑制CaSR活性，可能促进HSCs归巢至骨髓或从骨髓动员HSCs到外周。随后的研究也证实[20]，CaSR的激活与cAMP和前列腺素E2增高及PKC介导趋化因子受体4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4) 基因转录的结果相似，能使细胞外Ca2+的浓度增加到0.5~4 mmol·L-1，引起造血干/祖细胞表面的CXCR4表达量提高4倍左右，放大基质衍生因子-1(stroma derived factor-1，SDF-1) 结合CXCR4的效应，使HSCs趋化能力明显增强，HSCs的增殖、分化、归巢和成熟能力也明显提高。而这一作用可以被Ca2+通道抑制剂、CaSR单克隆抗体和蛋白合成抑制剂阻断，CXCR4拮抗剂AMD3100却不能抑制此过程，表明CaSR为Ca2+刺激CXCR4高表达及结合SDF-1效应的中间必需环节。Ca2+或CaSR激动剂西那卡塞等为CXCR4的活性调节剂，可以提高造血干/祖细胞的归巢、动员和增殖，提示在HSCs移植同时使用CXCR4的活性调节剂，可能会明显提高HSCs移植治疗效果。SDF-1与造血干/祖细胞表面CXCR 4结合后可引起细胞内Ca2+浓度增加，通过NF-κB、ERK和PI3等细胞信号通路，促进HSCs增殖、归巢和成熟，以及抑制造血细胞凋亡等，而活化的CaSR则通过NF-κB等途径参与调控SDF-1的信号通路，通过级联效应，上调CXCR4活性，从而影响造血干/祖细胞功能，促进骨髓造血功能恢复[21]。

干细胞niches为HSCs长期定植、存活和实现自我更新的特定场所，它主要由一些维持HSCs结构与功能的细胞、细胞因子和信号分子构成，如MSCs和内皮细胞及其旁分泌的多种细胞因子等，HSCs与niches内及骨内膜表面的细胞、分子相互作用维持着骨髓、外周血及其他组织HSCs分布的动态平衡。骨内膜niches内Ca2+浓度影响HSCs的定植、迁移和归巢，而HSCs上存在大量的CaSR，CaSR活化后，又可调控niches中Ca2+的浓度，进而促进HSCs的趋化运动及黏附于骨内膜表面，提高HSCs迁移率，增加HSCs向骨髓的迁移、归巢和在骨髓特定niches的定植与增殖[22]。Notch及其配体、Wnt/β-catenin、JAK/STAT通路、Cdx/HOX同源盒基因家族等信号途径也参与了HSCs迁移、归巢、增殖和分化的调控，说明CaSR激动剂或抑制剂对CaSR活性的影响可直接或间接地调控多种信号通路，从而影响HSCs的生物学行为[23]。

西那卡塞作为CaSR的别构激动剂，其主要的药理作用是降低Ca2+的调定点，在血清Ca2+浓度降低的基础上，通过NF-κB等细胞信号途径，提高CaSR对胞外Ca2+敏感性，从而降低血清PTH和血磷水平，临床上主要用于治疗甲状旁腺功能亢进等。西那卡塞还可通过刺激CaSR的表达，明显促进脐血HSCs形成红系爆式形成单位、粒细胞巨噬细胞集落形成单位和混合集落形成单位，从而增强骨髓造血功能恢复。我们近年的研究还发现[24]，人参皂苷Rg1与CaSR激动剂作用相似，对环磷酰胺诱导的严重骨髓抑制小鼠的造血及免疫功能具有明显的恢复作用，可明显上调骨髓单个核细胞CaSR mRNA表达水平和骨髓CaSR的蛋白表达水平，在早期便可提高骨髓与外周血Lin-Sca+c-kit+ HSCs的数量，提升红系、粒系及血小板在骨髓中的比例，明显改善骨髓造血微环境。相关研究表明[25]，人参皂苷Rg1促进骨髓HSCs向红系、粒系及血小板增殖分化的机制可能与CaSR介导的HSCs糖皮质激素受体的转录因子基因表达上调密切相关。人参皂苷Rg1通过对HSCs、骨髓MSCs、神经干细胞及内皮祖细胞等成体干细胞的增殖、分化、衰老与旁分泌的调控，在组织损伤和机体多种疾病中能产生明显的治疗效应[26]。

其他研究还发现[27]，表达于骨髓HSCs和Flk-1+CD34+内皮祖细胞的CaSR也受细胞外Ca2+浓度的影响而激活，通过CaSR介导的NF-κB、Notch或Wnt/β-catenin等细胞信号通路，上调血管内皮生长因子和转录因子 (Jag1、Fzd5、IGF-1、Angpt-2、Edg1和Epas1) 等，促进新生血管生成，而CaSR单克隆抗体可明显抑制这一促血管新生效应，表明活化的CaSR不但与骨髓HSCs的增殖、分化、迁移、黏附与归巢有关，还能明显的促进新生血管形成。

骨髓MSCs既是骨髓基质细胞的重要组分和异基因HSCs移植中的功能性干细胞，也是临床多种疾病细胞治疗的重要成体干细胞，具有支持造血、低免疫原性、多向分化能力，以及免疫调节、旁分泌、改善微环境，促进血管新生等功能，对心、肝、肺、脑、肾及骨关节等多种组织器官损伤性疾病，有着明显的再生与修复作用[28]。

表达于骨髓MSCs的CaSR激活后，通过促进PLC和PIP2产生IP3和DAG，激活下游的MAPK信号通路，进而促进细胞生长、增殖、分化及控制细胞凋亡等过程。Ca2+、西那卡塞及人参皂苷Rg1作为CaSR激动剂，通过刺激骨髓MSCs表面SDF-1/CXCR4的高表达，可以促进骨髓MSCs迁移、干细胞的靶向归巢及在niche中的增殖，从而提高骨髓MSCs移植的存活率及改善干细胞移植效果。骨髓MSCs的CaSR活化后，也可经ERK1/2信号转导途径，促进骨髓MSCs增殖，减少其凋亡，明显改善骨髓MSCs定植存活，而CaSR拮抗剂NPS2390和MEK1/2抑制剂U0126均可阻止这一效应[29]。动物和临床研究均表明，骨髓MSCs对异基因HSCs移植后所产生的移植物抗宿主病具有明显治疗效果，骨髓MSCs不但可促进HSCs的归巢和定植，还为HSCs的体内增殖和分化提供重要的微环境[30]，由此推测，CaSR激动剂，亦可能增强HSCs联合MSCs移植治疗的效果。

干细胞发育过程中，自我更新与功能性子代细胞的分化，既为疾病治疗提供了充足的功能性定向分化细胞，维持再生修复，又保持了微环境中原始干细胞的储备量。最近的研究发现，CaSR在调控干细胞自我更新与定向分化之间的平衡，及在调控干细胞功能特性中均发挥重要的作用，不但有利于人们深入理解干细胞的调控机制，更对利用干细胞治疗多种疾病有着特殊意义。CaSR被胞外高浓度Ca2+激活后，不但可以通过ERK1/2和骨形态发生蛋白-2介导的信号途径促进骨髓MSCs自身的增殖更新，还能增强MSCs向成骨细胞分化的能力，从而调控骨髓MSCs自我更新与成骨分化的平衡，CaSR的激活，还可明显上调碱性磷酸酶、骨钙蛋白、骨唾液酸蛋白和胶原蛋白Ia1的分泌表达，促进成骨细胞增殖、钙化，而成骨细胞就是一种重要的HSCs微环境组成成分，参与构成骨内膜，并维持HSCs的干性特征与功能[31]。CaSR作为一种潜在的骨诱导扳机，还在破骨细胞的分化和凋亡中扮演着重要角色，NF-κB和巨噬细胞集落刺激因子是破骨细胞形成、分化和凋亡中必不可少的两个因子，活化的CaSR通过PLC，诱导NF-κB信号通路激活，介导破骨细胞凋亡，导致溶骨作用明显受抑[32]。骨髓MSCs和HSCs所表达的CaSR同样可通过线粒体通路、内质网通路、MAPK以及NF-κB通路，启动过分增殖的干细胞、病理性增生的肿瘤细胞等的凋亡程序，发挥疾病治疗与延缓疾病进程的作用[33]。

展望

长期的研究已经确立了G蛋白偶联受体及其活性调节剂在生物医学及药学领域的突出地位，CaSR在生理状态和继发性甲状旁腺功能亢进中扮演的重要角色，也带来了GaSR临床应用的明显疗效。CaSR活性对HSCs及其微环境中骨髓MSCs、成骨细胞分化、破骨细胞凋亡及SDF-1/CXCR4信号通路等影响的不断阐明，更激起了人们探索CaSR激动剂/拮抗剂调节成体干细胞生物学功能与疾病治疗学的浓厚兴趣，显示CaSR激动剂/拮抗剂在HSCs和MSCs移植前后，动员或促进HSCs归巢的巨大应用潜力，就提高HSCs采集数量和移植治疗的疗效而言，可能具有重要的研发价值。因此，钙剂、西那卡塞或人参皂苷Rg1等影响CaSR活性及其表达水平的药物，不但在成体干细胞生物学功能及治疗学基础等方面，也在成骨与破骨、成血管和微环境调节等方面，都非常值得继续开展深入而全面的研究。