碧云天

使用说明： 1.样品的准备： a.细胞样品的准备。对于贴壁细胞，由于后续用于酶活性的测定，应避免使用胰酶消化细胞，可以用PBS、HBSS或生理盐水洗涤一遍。对于悬浮细胞，可以离心收集细胞，并用PBS、HBSS或生理盐水洗涤一遍。后续可以用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)参考相应的说明裂解细胞样品。按照每100万细胞直接加入100-200微升裂解液的比例进行裂解。对于贴壁细胞，可以使用细胞铲或细胞刮(FLFT021/FSCP023/FSCP029)辅助收集细胞样品。如果出现裂解效果不佳的情况，可以把处在裂解液中的细胞样品用玻璃匀浆器在4℃或冰浴匀浆。随后4℃，12,000×g离心10分钟。取上清用于酶活性的测定。 b.组织样品的准备。动物用含有0.16mg/ml heparin的生理盐水(0.9% NaCl containing 0.16mg/ml heparin)灌流清除血液后获取组织样品。按照约每20mg组织加入200微升Western及IP细胞裂解液(P0013)或其它适当的匀浆液的比例，用TissueMaster™手持式组织研磨仪(E6600)或玻璃匀浆器在4℃或冰浴匀浆。4℃，12,000×g离心10分钟。取上清用于酶活性的测定。 c.红细胞裂解液的准备。用抗凝管收集血液，颠倒混匀。取至少500微升全血4℃ 2500×g离心5分钟。弃上清，用冰冷的约红细胞沉淀10倍体积的Western及IP细胞裂解液(P0013)或其它适当的匀浆液重悬沉淀，再同前离心，弃上清。加入约红细胞沉淀4倍体积的冰冷的Milli-Q级纯水裂解红细胞。12,000×g离心5分钟，取上清。 d.上述各种样品可以用碧云天生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)测定蛋白浓度。通常可以先取含1-100微克蛋白的样品用于谷胱甘肽还原酶的检测。注：对于GR活力较高的组织样品，含1-10微克蛋白的样品可能就能满足检测需求，而对于GR活力较低的样品，可能需要10-100微克的蛋白量。如果发现样品中谷胱甘肽还原酶的活力过高，可以用样品稀释液进行稀释。如果样品中谷胱甘肽还原酶的活力过低，则需适当加大蛋白用量。准备好的样品如果当日测定，可以在冰浴或4℃临时保存；如果不能当日检测，可以-70℃冻存。 2.试剂盒的准备工作： a.配制6mM NADPH溶液的配制。在本试剂盒提供的5mg NADPH中加入1ml Milli-Q级纯水或重蒸水，溶解并混匀，即为6mM NADPH溶液。除立即待用部分外，其余的NADPH溶液需适当分装后尽快-70℃保存。 b.GSSG溶液的配制。在本试剂盒提供的14.2mg GSSG中加入10ml Milli-Q级纯水，溶解并混匀。除立即待用部分外，其余的GSSG溶液需适当分装后-20℃保存。 c.DTNB溶液的配制。在本试剂盒提供的4.5mg DTNB中加入1.5毫升本试剂盒提供的DMSO，溶解并混匀。除立即待用部分外，其余的DTNB溶液需适当分装后-20℃保存。 d.所有试剂在使用前均须在水浴中或PCR仪等设备上温育到25℃。 3.样品测定： a.参考下表(表1)，使用96孔板，依次加入各溶液，混匀。

b.加入6.6微升DTNB溶液，混匀。 c.立即使用适当的酶标仪或微量紫外分光光度计测定A412，此时记录为0分钟读值，即A412 (Time 0)。如果仪器可以设置温度，把温度设置在25℃，否则可以通过空调调节室温到25℃，待预计仪器也达到25℃后再开始测定A412。 d.每隔2分钟记录A412值，即A412 (Time n)，至少连续记录10分钟，获得5个点的数据。或者如果仪器具备相应功能，可以让仪器连续测定10分钟或自动每隔2分钟测定一次A412。如果样品的吸光度比较低，可以延长孵育时间，样品的吸光度在一定范围内会随时间的延长接近于线性增加的，此时可以考虑每10分钟测定一次吸光度。 4.样品中谷胱甘肽还原酶酶活力的计算： a.谷胱甘肽还原酶酶活力单位的定义：1个酶活力单位(1 unit)在25℃，pH7.5的条件下，在1分钟内可以还原化1微摩尔GSSG。1 U=1000 mU。 b.计算时每个样品的A412/min都需要扣除相应的样品本底对照测定出来的A412/min。测定出来的ΔA412/min最好能控制在0.005-0.1范围内。如测定出来的ΔA412/min数值过大，则可以把样品适当稀释或者减小样品的用量，如ΔA412/min数值过小，处理样品时需设法尽量浓缩样品、并适当加大样品的用量。肝脏裂解样品的实测效果参考图1。 注：ΔA412 (blank)=A412 (blank, Time n)-A412 (blank, Time 0); ΔA412 (sample)=A412 (sample, Time n)-A412 (sample, Time 0); ΔA412=ΔA412 (sample)-ΔA412 (blank); ΔA412/min=ΔA412/n c.对于谷胱甘肽还原酶：1mU/ml＝1nmol TNB/min/ml＝(ΔA412/min)/(εμM×L(cm)) 即相当于：[检测体系中谷胱甘肽还原酶活力]= (ΔA412/min)/(εμM×L(cm))=[(ΔA412 (sample)-ΔA412 (blank))/min]/ (εμM×L(cm)) [样品中谷胱甘肽还原酶活力]＝[检测体系中消耗谷胱甘肽还原酶活力]×[稀释倍数]/[样品中的蛋白浓度] = [(ΔA412/min)/(εμM×L(cm))]×[dil×(V(ml)/Vsample(ml))]/[样品中的蛋白浓度] 注：[检测体系中谷胱甘肽还原酶活力]的单位为mU/ml，[样品中的蛋白浓度]的单位为mg/ml，所以最终[样品中谷胱甘肽还原酶活力]的单位为：U/mg蛋白或mU/mg蛋白； εμM为摩尔消光系数：TNB在A412的摩尔消光系数为0.01415μM-1cm-1； L(cm)为测吸光度时的路径长度：200μl样品在一般的96孔中的高度约为0.552cm，如果使用不同的反应孔，请注意修改为溶液在该孔中的高度； dil为样品的稀释倍数； V(ml)为反应体系，本反应体系为0.2ml； Vsample(ml)为反应体系中样品的体积，以毫升表示。 d.计算示例：样品的蛋白浓度经测定为5mg/ml，用样品稀释液稀释10倍后，取10微升稀释后的样品参考表1进行测定。如果ΔA412/min(sample)＝0.048，ΔA412/min(blank)＝0.006，那么： [检测体系中谷胱甘肽还原酶活力]= (0.048-0.006)/(0.01415×0.552) =5.38mU/ml [样品中谷胱甘肽还原酶活力]= 5.38mU/ml×10×0.2/0.01/(5mg/ml)= 0.2152U/mg(蛋白)