NADP+/NADPH检测试剂盒(WST

使用说明： 1. 样品的准备： a. 细胞样品的准备：对于贴壁细胞，约1×106个细胞(大约相当于6孔板一个孔长满的细胞数量)，吸净培养液，用移液器加入200μl的NADP+/NADPH提取液，并轻轻吹打，以促进细胞的裂解；对于悬浮细胞，约1×106个细胞，600g离心5分钟，吸净培养液，用移液器加入200μl冰浴预冷的NADP+/NADPH提取液，并轻轻吹打，以促进细胞的裂解；裂解过程在室温或冰上操作均可。随后12,000g，4℃离心5-10分钟，取上清作为待测样品备用。 b. 组织样品的准备：冰上预冷的PBS洗涤组织后，称取约10-30mg的组织样品，用剪刀剪碎，置于匀浆器中，加入400μl的NADP+/NADPH提取液在室温或冰上进行匀浆。随后12,000g，4℃离心5-10分钟，取上清作为待测样品备用。 2. 试剂盒的准备工作： a. NADPH标准品的配制：吸取6ml超纯水充分溶解本试剂盒提供的5mg NADPH后即得到1mM NADPH标准品。1mM NADPH标准品请适当分装后-80℃避光保存。 b. NADPH标准曲线的设置：把1mM的NADPH标准品用NADP+/NADPH提取液稀释成适当的浓度梯度，如初次检测可以设置0、0.25、0.5、1、2、4、6、8μM这几个浓度，检测时96孔板每孔加入50μl的标准品，相当于每孔为0、12.5、25、50、100、200、300、400pmol的NADPH。如有必要，在后续的实验中可以根据样品中的NADPH含量对标准品的浓度范围进行适当调整。其中浓度为0μM的点为空白对照点，仅含NADP+/NADPH提取液。注意：由于NADPH很不稳定，故配制后需尽快使用。 c. G6PDH工作液的配制：将G6PDH用反应缓冲液稀释50倍，例如2μl G6PDH加入到98μl的反应缓冲液中，即可获得100μl的G6PDH工作液。每个标准品或样品的检测需要使用100μl的G6PDH工作液，请根据所需检测的标准品和样品的数量，配制适量的G6PDH工作液，并注意现配现用。 3. 样品测定： a. 样品中NADP+和NADPH总量的测定：吸取50μl待测样品至96孔板中，为了减少实验误差请设置样品的重复孔。后续如果发现样品中的NADP+和NADPH的总量过高，超出标准曲线的范围，则需要用NADP+/NADPH提取液将样品适当稀释后再进行检测；总量过低时则需要加大细胞或组织样品的用量。 b. 样品中NADP+、NADPH的含量或者NADP+/NADPH比值的测定：吸取100-200μl待测样品于离心管中，60℃水浴或PCR仪上加热30分钟以分解NADP+。如果加热后产生不溶物，则需10,000g，室温或4℃离心5分钟，吸取50μl上清液作为待测样品至96孔板中，为了减少实验误差建议设置样品的重复孔。后续如果发现样品中的NADP+或NADPH的含量过高，超出标准曲线的范围，则需要用NADP+/NADPH提取液将样品适当稀释后再进行检测；含量过低时则需要加大细胞或组织样品的用量。 c. 请参考下表使用96孔板设置空白对照孔、标准品孔和样品孔。加入G6PDH工作液后充分混匀。

d. 37℃避光孵育10分钟。说明：此孵育步骤的目的是将样品中的NADP+转化为NADPH；在加入G6PDH工作液过程中须轻柔操作，以免产生气泡。若不慎出现气泡，可使用细小的吸头或针头戳破。 e. 适当混匀显色液，然后每孔加入10μl显色液，混匀，37℃避光孵育10-20分钟，此时会形成橙黄色的formazan。测量450nm处的吸光度。如果显色较浅，也可以适当延长孵育时间至30-60分钟，随着孵育时间延长，显色会逐渐加深。 4. 样品中NADP+/NADPH量的计算： a. 计算标准品组中每个点的平均吸光度，减去空白对照组的吸光度，即为各个标准品的吸光度。 b. 以NADPH的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制出标准曲线。NADPH标准品的检测效果请参考图2。如果孵育时间过长，高浓度标准品的显色会达到平台，此时宜选择未达到平台的标准品来绘制标准曲线，或者选择孵育时间较短的标准品吸光度数据来绘制标准曲线。

c. 根据标准曲线计算细胞、组织等样品中的NADP+和NADPH总浓度或者NADPH的浓度。未60℃加热处理时，计算得到的是样品中NADP+和NADPH总量的浓度(NADPtotal)；60℃加热处理后，检测得到的是样品中NADPH的浓度。 备注：根据检测得到的浓度及样品的体积，即可计算出NADP+、NADPH、NADPtotal的量。 d. 根据如下计算公式，计算样品中NADP+的量以及NADP+/NADPH的比值。此时可以把NADP+和NADPH总量或各自的含量用单位细胞数量或单位组织重量中的含量来表示。   [NADP+] = [NADPtotal] - [NADPH]   [NADP+]/[NADPH] = ([NADPtotal] - [NADPH])/[NADPH] e. 如果希望更加精确地来表述NADP+和NADPH总量或各自的含量，可以将样品用BCA法测定蛋白浓度。最终用单位蛋白量中NADP+和NADPH总量或各自的含量来比较精确地进行表述。