浒苔(Ulva prolifera)共附生细菌群落结构分析的引物优化

细菌既可附生在海洋藻类表面, 也可在藻类细胞内共生[1]。海藻与其共附生细菌之间存在着复杂的相互作用, 一方面, 海藻分泌的有机物质可被细菌利用[2], 另一方面, 细菌也密切参与藻类的营养吸收、生长发育等重要过程[3-5]。近年来, 随着分子生物学技术的发展, 藻类共附生细菌群落结构的研究得以较广泛地开展[6], 普遍认为, 共附生细菌的群落组成与藻类宿主之间具有一定的特异性和功能相关性[7-12], 这为深入研究重要菌群的生态功能、揭示藻菌相互作用机制提供了重要背景。

目前, 相关研究主要针对的是藻类体表的附生菌, 方法是首先通过物理或酶解手段从藻体分离得到附生菌体, 再制备DNA模板, 利用16S rDNA通用引物进行扩增测序与分析[7, 9-10]。相较外附生细菌, 藻类内生菌的生态功能更加引人关注[12-14], 但由于目前仍缺乏普遍适用的内生菌分离富集的方法, 因此, 针对内生或共附生细菌群落结构的研究, 只能制备宿主与共附生细菌的混合DNA模板进行扩增。研究发现, 在利用细菌通用引物27F/1492R进行扩增时, 由于宿主叶绿体基因组编码的16S rDNA具备原核特征和高拷贝数, 往往在扩增产物中占据较高比例, 对后续菌群结构分析带来严重影响。为此, Chelius等设计了引物799F, 利用引物3′末端与玉米叶绿体同源序列之间存在两个碱基的差异, 使用799F/1492R引物对, 扩增细菌16S rDNA中具高分辨率的V5-V9可变区, 成功避免了玉米叶绿体的干扰[15]。引物799F在大米等多种高等植物中也获得成功[16-17], 但在拟南芥、柑橘中效果并不理想[18-19], 原因尚未深入分析。

浒苔(Ulva prolifera)属大型绿藻, 是形成黄海绿潮的优势种[20], Liu等通过物理方法分离浒苔表面附生菌开展了多样性分析[21]。我们前期研究发现, 浒苔中还存在内共生细菌[22], 对其共附生细菌合并开展群落结构分析有望为成灾机制研究提供重要线索。绿藻相关研究中同样面临叶绿体干扰的严重影响[23], 但尚未对引物799F开展评价。本文以大型绿藻浒苔为材料, 研究了引物799F的适用性, 通过比较和优化, 建立了可应用于浒苔共附生细菌群落结构分析的扩增体系, 并阐明了原理。

浒苔(U. prolifera)样本Up1于2014年采集于江苏外海(N33.1°, E122.5°), 样本Up2于2007年采集于青岛沿海, 样本Up3于2011年采集于连云港沿岸。用105℃灭菌30 min的海水冲洗藻体以去除污染, Up1单株于–20℃冻存, Up2、Up3单株于VSE培养液中增殖培养。

Taq酶、Taq Hot Start Version、Ex Taq均系TaKaRa (大连, 中国)产品。Taq Hot Start Version是基于Taq酶的热启动Taq酶, 二者均不具3′-5′外切酶活性。Ex Taq是具3′-5′外切酶活性的DNA聚合酶, 具有更高的保真性。

CTAB法制备浒苔总DNA模板[24], 由于叶绿体编码的16S rDNA具有原核特征与高拷贝数[23], 因此, 利用通用引物对27F/1492R(表 1)进行扩增, 程序为: 94℃预变性10 min后进行30个循环(94℃变性1 min, 56℃退火1 min, 72℃延伸2 min), 最后72℃进行5 min延伸。PCR产物经胶回收试剂盒(天根)纯化后, 连接pGEM-T Easy载体(Promega)构建克隆文库, 挑选有效插入克隆在上海桑尼公司测序, 测序结果经序列比对与邻接法(Neighbor Joining, NJ)建树分析, 从而确定浒苔叶绿体16SrDNA序列片段。

利用藻菌混合DNA扩增16S rDNA片段构建克隆文库时, 需要建立快速鉴定的方法, 以判断浒苔叶绿体来源序列的占比。为此, 将测得的浒苔叶绿体16S rDNA序列与20条来自蓝藻门以及64条来自31个细菌门类(Proteobacteria、Bacteroidetes、Planctomycetes、Caldiserica、Deinococcus、Fusobacteria、Tenericutes、Thermodesulfobacteria、Verrucomicrobia、Armatimonadetes、Actinobacteria、Chlamydiae、Chlorobi、Chrysiogenetes、Deferribacteres、Nitrospirae、Spirochaetes、Synergistetes、Thermotogae、Dictyoglomi、Elusimicrobia、Gemmatmonadetes、Ignavibacteriae、Cloacimonetes、Nitrospinae、Aquificae、Microgenomates、Acidobacteria、Marinimicrobia、Poribacteria、WPS-2类群)的同源序列进行比对, 选择799-1492区域, 用Primer 5.0分析限制性内切酶的酶切位点, 寻找并验证可在浒苔叶绿体序列中切割产生特征性带型的限制性内切酶。

之后, 针对引物对799F/1492R或800F/1492R (表 1)扩增产物的克隆文库, 我们挑选克隆, 以pGEM-T Easy克隆载体的通用引物对SP6/T7进行扩增, 一方面判断是否有预期大小片段的插入, 同时对扩增产物进行限制性内切酶酶切, 利用上述酶切指纹图谱快速判断是否为浒苔叶绿体来源; 针对引物对799F/1100R的扩增产物, 因片段较短, 仍通过测序方法判断其序列的来源。

共使用三条细菌16S rDNA通用引物(799F、1100R、1492R)与一条新设计引物(800F)用于共附生细菌16S rDNA片段扩增(表 1)。根据表 2, 针对三对配对引物、三个浒苔样本、两个退火温度和三类DNA聚合酶, 共设计10组PCR扩增试验组合, 扩增程序为: 94℃预变性10 min后进行30个循环, 94℃变性1 min, 52℃(或56℃)退火1 min, 72℃延伸1 min, 最后72℃进行5 min延伸。扩增产物回收与构建克隆文库同1.3, 使用通用引物对SP6/T7检测阳性克隆。利用1.4方法鉴定并统计叶绿体来源克隆在所有阳性克隆中的占比。

利用16S rDNA通用引物对27F/1492R扩增浒苔总DNA模板, 获得产物经挑选克隆测序, 5个克隆获得一致序列, 经构建系统发育树, 该序列(标注为Ulva prolifera)与绿藻叶绿体16S rDNA聚在一类(图 1), 提示所有克隆序列全部为浒苔叶绿体来源, 无一来自细菌的同源序列。序列比对结果显示, 该序列具有与细菌同源序列高度相似的可变区、保守区结构特征。进一步比对发现, 该序列与细菌16S rDNA通用引物27F、515F、806R、926R、1492R(表 1)的序列均完全匹配。除了27F/1492R, 我们还评价了515F/ 806R、515F/926R等引物对的扩增效果, 发现与27F/1492R的表现基本一致, 结果表明, 使用不经优化的细菌通用引物进行扩增, 会受到叶绿体同源序列的强烈干扰, 难以获得高丰度的来自细菌的扩增产物。

将获得的浒苔叶绿体16S rDNA序列与20条来自蓝藻门和64条来自31个细菌门类的同源序列进行比对与酶切位点分析, 发现在引物对799F/1492或800F/1492的扩增范围内, 限制性内切酶Hha Ⅰ和Sma Ⅰ理论上可切割叶绿体编码序列产生不同于细菌门类的特征性带型。其中, Hha Ⅰ酶切应产生约410 bp与460 bp两条带, 而Sma Ⅰ酶切应产生约510 bp、190 bp与170 bp三条带。

接下来酶切检验的结果完全验证了上述分析。从引物对799F/1492R或800F/1492R扩增产物的克隆文库中挑选克隆, 以pGEM-T Easy克隆载体的通用引物对SP6/T7进行扩增, 对扩增片段分别进行Hha Ⅰ或Sma Ⅰ酶切, 结果表明, 获得特征性指纹图谱的经测序均为叶绿体来源序列(图 2), 而其余克隆经测序均为细菌来源序列(图 3)。图 2中, 所有扩增产物来自浒苔叶绿体, 两种酶的指纹图谱表现均非常稳定; 图 3中, 扩增产物全部来自细菌的不同克隆, 具有明显的多态性, 且均与浒苔叶绿体的特征图谱明显不同。该方法后续用于快速鉴定引物对799F/1492R或800F/1492R扩增产物克隆文库中浒苔叶绿体来源的序列。

序列比对发现, 引物799F在3′最末端与浒苔叶绿体16S rDNA序列仅存在一位差异碱基(图 4), 799F为鸟嘌呤(G), 而叶绿体序列为腺嘌呤(A)。以藻菌总DNA为模板, 引物799F的检验与优化结果见表 2。结果表明, 无论使用普通Taq酶还是具热启动活性的Taq Hot Start Version, 甚至将退火温度自52℃提升至56℃, 引物对799F/1492R在浒苔样本中的表现均不佳, 经酶切鉴定, 总计3组中高达83.3%-100%的扩增克隆为叶绿体来源, 表明799F/1492R几乎无法获得来自共附生细菌的16S rDNA扩增产物。

与反向通用引物1100R序列比对发现, 其3′最末端与浒苔叶绿体序列也存在单碱基差异(图 4), 1100R为鸟嘌呤(G), 而叶绿体序列为腺嘌呤(A)。组合使用799F/1100R引物对, 用Taq酶扩增Up1模板, 叶绿体来源序列占比下降至60%;改用Taq Hot Start Version, 占比可进一步下降至50%, 优化程度仍无法满足对共附生菌群落结构分析的要求。

在引物799F的基础上, 向3′方向延伸1位与模板配对的碱基鸟嘌呤(G), 设计了新引物800F(图 4)。使用800F/1492R引物对, 用Taq酶扩增Up1模板, 叶绿体来源序列的占比可显著下降至41.7%。为了评估不同类型DNA聚合酶对扩增特异性的影响, 分别比较了具3′-5′外切酶活性的高保真Ex Taq与Taq Hot Start Version。使用前者替换Taq酶, 叶绿体来源序列的占比反而高达100%, 而用后者替换Taq酶, 发现可完全消除叶绿体干扰, 而且相同扩增体系同样适用于浒苔Up2样本的模板, 使用Up3模板, 叶绿体来源序列的占比也仅为8.3%, 可完全满足共附生细菌群落结构分析的试验要求。

引物的3′末端序列对于PCR反应的延伸至关重要。引物799F在某些高等植物中可完全避免叶绿体来源序列的扩增, 从而满足其共附生菌群结构分析的需要。其原理可能在于, 799F的3′最末端往往与高等植物叶绿体DNA存在两个非配对碱基, 二者退火结合后, 两个非配对的摆动碱基会导致DNA聚合酶难以进一步聚合延伸[15]。

本文使用27F/1492R引物对扩增得到浒苔叶绿体16S rDNA片段。比对发现, 引物799F的3′最末端与浒苔叶绿体序列仅存在单碱基差异, 这可能是导致引物799F在浒苔中扩增特异性不强、叶绿体干扰严重的主要原因。即使提高退火温度, 引物799F仍可以与叶绿体DNA模板退火结合, 且3′末端未发生配对的单一碱基不能阻止以叶绿体DNA为模板的非特异性扩增, 由于叶绿体基因组具有高拷贝数, 使得扩增产物中叶绿体来源序列占比超过80%, 这一结果表明, 高等植物中通用引物对799F/1492R的扩增体系不能直接应用于浒苔共附生细菌群落结构的分析。

通用引物1100R在3′最末端与浒苔叶绿体序列也存在一个单碱基差异。与799F/1492R中仅799F具有选择性不同, 引物对799F/1100R中两端的扩增引物均能发挥一定程度的选择性, 理论上有利于明显降低叶绿体的干扰。但实验结果显示, 这一策略仅能够使扩增产物中浒苔叶绿体来源序列的比例下降到50-60%。这说明, 引物3′末端仅保留1位不匹配碱基是无法显著提升扩增特异性、避免叶绿体干扰的。

我们设计的新引物800F与通用引物1492R的配对取得了理想的效果。引物800F系由799F向3′末端延伸了一位碱基鸟嘌呤(G), 这一碱基与浒苔叶绿体及细菌同源序列中该位置的碱基匹配。使用Taq酶进行扩增, 叶绿体来源序列占比进一步降至41.7%, 较引物对799F/1492R(占比100%)有明显优化。我们推测其原因在于, 800F与叶绿体同源序列退火结合时, 由于3′端倒数第二位存在非配对碱基G, 导致最末端的匹配碱基G也不能与叶绿体同源序列退火结合, 从而产生了一个双碱基的摆动末端GG, 使得DNA聚合酶难以进一步聚合延伸; 但在升降温过程中低于退火温度的条件下, 800F的3′端仍可能与叶绿体同源序列发生完全退火, 使得延伸得以进行, 从而产生非特异的叶绿体来源的扩增产物。

为了验证这一假设并进一步优化, 我们比较了具有3′-5′外切酶活性的Ex Taq以及具热启动活性的Taq Hot Start Version, 结果完全符合预期。当引物800F与叶绿体模板非特异性结合时, 由于Ex Taq存在校对功能, 推测其对引物800F的游离双碱基3′末端进行了加工剪切, 从而使得延伸得以进行, 最终产生了100%的叶绿体来源序列。而Taq Hot Start Version由于不具备校对功能, 并且可抑制低温条件下引物800F的非特异性扩增, 从而基本完全避免了叶绿体的干扰。

综上所述, 我们在引物799F的基础上, 设计了新引物800F, 与通用引物1492R配对, 使用具热启动功能、同时不具校对功能的DNA聚合酶, 扩增细菌16S rDNA中具高分辨率的V5-V9可变区, 可完全满足浒苔共附生细菌多样性组成分析的试验需求。